Intan RHS16通谈仪器通过评估糊口、神经保护和潜在的作用机制

一、简介

腹黑骤停（CA）是一个紧要的健康危急，死字率相当高，在好意思国每年导致向上30万东谈主死字，大多量患者在出院前未能存活。盘考标明，腹黑骤停后的糊口可能取决于复苏后大脑保护的进程，这一直是大多量临床医师濒临的主要放浪。跟着先进人命守旧方法，如体外膜肺氧合（ECMO）和低温调整工夫的最新进展，东谈主们对改善大脑保护抱有乐不雅魄力。然则，这些非特异性工夫可能无法凯旋提供神经保护，这就需要更有针对性的药物侵扰。大脑和其他好多器官在腹黑骤停后资历了多样病理变化，如氧化应激加多、代谢和能量产生转换以及大脑自动调整功能失调。一个主要的病理起首，也可能成为腹黑骤停后潜在的忖度打算，是线粒体。缺血/再灌输损害（IRI）导致的线粒体损害会导致能量和代谢功能禁锢，以及细胞死字路子的传播。因此，好多盘考试图通过多种方法在腹黑骤停后进行线粒体保护，举例使用SS-31保护线粒体膜和脂质，使用MitoSNO调整线粒体活性氧种（ROS）的产生，或者使用环孢素A通过线粒体通透性盘曲孔复合物（MPTP）缓解线粒体梯度的失稳。然则，这些新侵扰步调的机制，终点是在线粒体的布景下，尚未澈底了解，这给盘考东谈主员将这些疗法垄断于东谈主类腹黑骤停患者带来了挑战。

绕过这些挑战的一种方法是将一种在东谈主类中使用相对安全且大概针对疾病多个靶点的常用药物从头定位，举例二甲双胍。尽管二甲双胍的果真作用机制尚不解确，但它被精深用作调整2型糖尿病的一线药物。此外，除了其在糖尿病中的作用外，二甲双胍还被合计具有抗软弱和抗肿瘤特质，并提供对糖尿病心血管和神经后遗症的保护。二甲双胍还大概通过调整线粒体来阐发其益处。因此，在自愿轮回复原（ROSC）后执行二甲双胍调整可能大概在腹黑骤停后提供有益的落幕，因为它可能大概凯旋影响腹黑骤停后损害的一个主要起首。

二甲双胍当作腹黑骤停（CA）调整的调整后果和可能的作用机制尚不明晰。一项使用9分钟窒息-腹黑骤停的大鼠模子的盘考评估了二甲双胍预处理2周对糊口和神经学落幕的影响，发现7天糊口率教养和神经裂缝减少。不雅察到的主要调整机制是二甲双胍蛊卦的AMPK依赖性自噬激活，这有助于保护大脑免受IRI的损害。长期预处理二甲双胍似乎导致了更权臣的AMPK激活。这标明慢性二甲双胍调整可能具有改善腹黑骤停后糊口的后劲。一些盘考将二甲双胍当作IRI潜在调整的盘考使用了局部损害模子，如中风或心肌梗死。在大鼠模子中，不管是在心肌梗死前如故再灌输前提供二甲双胍，齐能通过加多AMPK的激活，进而加多eNOS的激活，从而提供权臣的腹黑保护。然则，在中线动脉闭塞的大鼠模子中，慢性而非急性预处理二甲双胍通过nNOS介导了神经保护，但莫得加多AMPK。这与盘考标明二甲双胍通过促进AMPK改善中风落幕的盘考相矛盾。然则，二甲双胍可能还有另一个主要机制。癌症和代谢疾病盘考标明，二甲双胍的作用是通过线粒体介导的。最近的一项meta分析标明，与另一种抗糖尿病药物比拟，二甲双胍大概减少冠状动脉疾病患者的全因死字率。一项试点盘考标明，与未使用二甲双胍的患者比拟，使用二甲双胍的东谈主类患者在一忽儿腹黑骤停（SCA）后显现出腹黑和肾功能参数的改善，这一发现也在SCA小鼠模子中获得了阐明。慢性、预处理二甲双胍的保护性质和有益健康落幕的有劲笔据正在增长。尽管二甲双胍在IRI后调整益处的时机、剂量和机制复杂不清，但它是一个值得探索的调整采用。在咱们的盘考中，咱们评估了在大鼠10分钟窒息性腹黑骤停模子中，腹黑骤停后予以二甲双胍的调整益处，通过评估糊口、神经保护和潜在的作用机制。

二、材料与方法

2.1 动物实验枢纽：10分钟窒息性腹黑骤停

总共实验均按照动物存眷和使用委员会（IACUC）指南的批准进行。雄性Sprague-Dawley大鼠在实验前被安置在12小时明暗轮流的环境中，摆脱饮水和进食。蛊卦窒息的枢纽已在前文发表。简而言之，大鼠用4%异氟醚麻醉，用14号塑料导管插管，并在2%异氟醚下进行机械通气。左股动脉和静脉分别用聚乙烯导管插管，以测量动脉压力和药物输注。在手术准备和肝素打针（300 IU）后，不雅察动物的动脉平均压力（MAP）是否复原平淡。纪录平均动脉压力、心率、呼气末CO2（ETCO2）的基线，这些纪录在腹黑骤停时间以及ROSC后2小时继续进行。腹黑骤停的枢纽运行于通过左股静脉冉冉打针维库溴铵（按体重2 mg/Kg），打针时候隔断为4分钟。维库溴铵打针3分钟后，通过关闭呼吸机和随后罢手异氟醚来蛊卦窒息性腹黑骤停。平均动脉压力低于20 mmHg被界说为腹黑骤停19。未经调整的窒息性腹黑骤停10分钟后，复苏运行，复原在100%氧气下的通气，运行胸外按压，并打针20 μg/Kg的肾上腺素以已毕ROSC，界说为MAP大于60 mmHg。大鼠在ROSC后2小时内继续在呼吸机上监测。通过提供外部热量保执食管温度在37 ± 0.5℃。ROSC后2小时，大鼠从呼吸机上撤下，总共导管被移除，伤口被缝合。然后大鼠被送回动物饲养设施，并根据批准的决策提供日常照顾。要是动物在CPR运行后5分钟内莫得已毕ROSC，则不被纳入盘考。动物被监测72小时糊口期。然后对动物进行安乐死，得益通盘大脑用于组织学和生物化学分析。为了与非腹黑骤停动物进行比较，根据相应实验的决策，假手术动物被深度麻醉并安乐死以收罗组织。实验决策的暗示图显现在图1中。

图1. 实验联想。大鼠腹黑骤停后糊口（顶部）和用于EEG纪录、线粒体分离及生物化学分析（底部）的实验联想的暗示图清楚。

2.2 二甲双胍给药的实验联想

大鼠被赶紧分派到载体组或二甲双胍调整组。动物在已毕ROSC后15-20分钟内，通过股静脉打针载体（生理盐水）或二甲双胍（100 mg/kg体重，溶于2 mL生理盐水）给药。血液从股动脉收罗，分别在基线、ROSC、ROSC后20分钟和40分钟。然后将血液样本在1000 x g下离心10分钟以分离血浆，收罗的血浆立即冷冻并在-80°C下储存以进行进一步的生物化学分析。关于动脉血化学分析，测量基线、ROSC后20分钟和40分钟的pH、pCO2、pO2、HCO3、乳酸和血氧敷裕度。血糖测量在基线、ROSC、ROSC后20分钟和40分钟进行。

2.3 纪录复苏后24、48和72小时的神经裂缝评分

经过10分钟腹黑骤停和ROSC后进行CPR的大鼠被监测72小时糊口期以纪录存活率（每组n=20）。为了测量神经复原，接受盲法进行校正神经裂缝评分（mNDS）的纪录，这是基于先前建树的方法的修改版（表S1）。在ROSC后24、48和72小时监测mNDS值（mNDS，0-500；0，脑死字；500，平淡）。

表1.载体和二甲双胍调整组内动脉血液化学分析群组。在载体处理组和二甲双胍处理组之间莫得不雅察到统计学上的权臣性各异。在每个组内的总共参数齐不雅察到了统计学上的权臣各异。*p<0.05 清楚与基线水平比拟有统计学权臣性各异；**p<0.01 清楚与基线水平比拟有更高的统计学权臣性各异；***p<0.001 清楚与基线水平比拟有极高的统计学权臣性各异。#p<0.05 清楚与复原自主轮回后20分钟水平比拟有统计学权臣性各异；##p<0.01 清楚与复原自主轮回后20分钟水平比拟有更高的统计学权臣性各异；###p<0.001 清楚与复原自主轮回后20分钟水平比拟有极高的统计学权臣性各异；####p<0.0001 清楚与复原自主轮回后20分钟水平比拟有极高的统计学权臣性各异。$p<0.05 清楚与复原自主轮回后40分钟水平比拟有统计学权臣性各异；$$p<0.01 清楚与复原自主轮回后40分钟水平比拟有更高的统计学权臣性各异；$$$p<0.001 清楚与复原自主轮回后40分钟水平比拟有极高的统计学权臣性各异；$$$$p<0.0001 清楚与复原自主轮回后40分钟水平比拟有极高的统计学权臣性各异。数据以平均值 ± 圭臬罪责（SEM）的情势呈现。CA 代表腹黑骤停；ROSC 代表复原自主轮回。

2.4 10分钟腹黑骤停和复苏后的定量脑电图分析

咱们在基线和ROSC后2小时内测量EEG。简而言之，在大鼠进行插管和插管之前，先用异氟醚麻醉，然后放弃在立体定位安装上。EEG电极植入是在前额叶和顶叶皮层进行的双侧操作。每只动物在大脑图谱的领导下，使用螺丝电极在距bregma 2 mm侧向和2 mm前后位置植入皮层。此外，接地电极放弃在距bregma 2 mm右侧和9 mm前列的中线上的右侧额叶旁矢状面。EEG使用Intan RHS Stim/Recording 16通谈仪器（Intan Technologies, USA）在基线和ROSC跋文录。原始EEG信号用于细则EEG电举止。

东莞富临医疗科技有限公司是神经科学电生理范畴的大师，咱们供应Intan Technologies全系列家具。

数字化的脑电图（EEG）信号使用MATLAB, 版块9.0.0341360 (R2016a)进行分析。在完成动物纪录（载体组和二甲双胍调整组各n=6）后，总共基线和复苏后期的EEG信号齐经过东谈主工搜检，以检测纪录中的任何畸形。要是动物在已毕ROSC后不久死字，或者显现出严重的EEG纪录畸形（即：信号/噪声比无法分袂），则被摒除。在东谈主工搜检后，总共EEG信号齐由寂寥、盲视的盘考者标记为等电位/遏制或爆发遏制。用于分类的圭臬如下：1）当至少30秒时候内莫得权臣EEG时，识别为等电位/遏制；2）EEG振幅> 10μV用于检测爆发，爆发遏制的特征是爆发之间至少有0.5秒的EEG举止缺失（或EEG振幅< 10μV）。

在此分类之后，采用了基线和ROSC后每10分钟标记的无伪迹EEG片断。EEG片断被处理以去除任何偏移和高频噪声。咱们使用了0.3-100 Hz领域内的带通滤波器。EEG片断被用于爆发遏制忖度打算。爆发遏制比（BSR）不错界说为爆发信号的执续时候与信号总执续时候的比例。咱们忖度打算了每个通谈和每种条目下的BSR。在每种条目下，总共时段的BSR在总共通谈上平均，并用于后续的统计分析。齐全的实验联想显现在图S1中。

2.5 组织学和染色

在ROSC后72小时，存活的动物在麻醉下进行腹黑灌输，使用冷的磷酸盐缓冲生理盐水（PBS，1X，pH=7.4）。假手术动物短长腹黑骤停的大鼠，经过PBS再灌输后深度麻醉并安乐死。从假手术组或实验组得益通盘大脑，并在4°C下用4%多聚甲醛（PFA）固定。在PBS中的30%蔗糖溶液中进行冷冻保存后，使用冷冻切片机切割含有海马区的冠状序列（14 μm）并收罗在涂有载玻片的玻璃片上。尼氏染色、NeuN和GFAP染色是按照先前建树的方法进行的，而TUNEL染色则是根据制造商的阐述进行的。NeuN和GFAP免疫染色是在使用抗原回收溶液进行抗原回收后进行的，并在压力锅中孵育5分钟。抗原回收后，载玻片在0.25% Triton X中孵育20分钟（在1X TBST中）并在室温下用2%平淡驴血清在1X TBST中阻塞。孵育后，切片在鼠抗大鼠NeuN（1:500）和兔抗大鼠GFAP（1:500）抗体中孵育，这些抗体用2% NDS在1X TBST中制备。载玻片在4°C下轻轻摇动过夜。关于双重免疫染色，载玻片用1X TBS洗涤3次，并在室温下与NeuN（绿色，AlexaFluor 488，驴抗鼠，1:400）和星形细胞（红色，AlexaFluor 594，驴抗兔，1:400）的次级抗体孵育1小时。孵育后，载玻片用1X TBS洗涤三次，随后用水洗涤，并使用含有DAPI的Fluoroshield封片剂进行封片。

海马CA1区来自假手术、载体和二甲双胍组（每组n=4）的锥体神经元在BX-X800明场显微镜下以40X放大率双侧成像。使用BX-X800分析仪对来自海马CA1区的缺血（尼氏染色）和凋一火细胞（TUNEL染色）进行半定量分析，取两个半球的平均值。关于NeuN和GFAP，使用BX-X800荧显豁微镜对海马CA1区域进行成像。使用ImageJ对来自两个海马CA1区域的神经元和星形细胞进行半定量分析，然后取平均值。总共计数齐是在焦点区域内进行的。

2.6 大脑组织中AMPK mRNA和卵白含量的评估

按照先前报谈的方法大脑组织进行免疫踪迹分析。使用脑匀浆进行p-AMPK α、p-AMPK β1、总AMPK α和总AMPK β1/2的Western blot分析。假手术动物短长腹黑骤停的大鼠，经过深度麻醉和安乐死。简而言之，假手术（n=3）、载体和二甲双胍处理的大鼠（每组n=4）使用冷的磷酸盐缓冲生理盐水（PBS，1X，pH=7.4）进行腹黑灌输，并收罗通盘大脑。大脑被快速冷冻并研磨成粉末。取20 mg研磨的大脑，加入100 μL含Pierce卵白酶遏制剂和1 mM硫酸钠的RIPA缓冲液；在冰上超声波处理5次，每次10秒。使用二辛可宁酸卵白测定法对大鼠血浆中的卵白浓度进行定量。样品用Laemmli SDS样品缓冲液稀释，并在95-100°C下加热5分钟后，在4°C下以16,000 x g离心2分钟。样品使用4–20%预制聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并移动到聚偏二氟乙烯膜。在阻塞后，膜在4°C下与p-AMPK α、p-AMPK β1、总AMPK α和总AMPK β1/2的一级抗体孵育过夜。检测使用抗兔辣根过氧化物酶偶联的次级抗体。膜使用增强化学发光检测法进行检测，并使用ChemiDoc MP成像系统成像，使用Image Lab软件进行定量。卵白含量以评估的亚单元中p-AMPK/总AMPK的比例进行量化。

AMPKα1、AMPKα2和AMPKβ mRNA的抒发通过使用RT-qPCR进行测量，使用CFX-96及时PCR系统。RT-qPCR TaqMan检测使用BrightGen HER2 RT-qDx检测套件进行。mRNA的及时PCR扩增使用总体积20 μL（10 μL的2x Thunderbird探针qPCR混杂物，5 μL的引物和TaqMan探针混杂物，2 μL的模板cDNA和3.0 µl无核酸酶的水）。PCR轮回条目为95°C 3分钟，随后在95°C 15秒和55°C 30秒下进行40个轮回。为了幸免由于mRNA降解导致的假阴性，使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）当作内源性对照。忖度打算mRNA抒发（倍变化）联系于GAPDH是通过CFX Manager软件v1.6或Genex软件使用比较Ct方法自动忖度打算的，分袂阳性和阴性落幕的截止值是相对HER2 mRNA抒发水平为100。

2.7 分离大脑线粒体

在大鼠深度麻醉和安乐身后的假手术（非CA）动物（n=6）以及ROSC后2小时的载体和二甲双胍处理的大鼠（每组n=6）中，使用校正的差速离心法分离大脑线粒体，如前文发表所述。总共枢纽均在4°C下进行。简而言之，大脑被放入线粒体分离缓冲液（MESH）中，该缓冲液由210 mM甘霖醇、70 mM蔗糖、10 mM Hepes、0.2 mM EGTA构成，pH为7.3。去除脊髓的大脑被拭干、称重，并放入含有0.2% w/v无脂肪酸牛血白皙卵白（MESH-BSA）的MESH缓冲液中。大脑被切碎，并加入10 mL/g组织的MESH-BSA。随后使用特氟龙/玻璃驱动匀浆器进行匀浆，8次打击。匀浆在5600 x g下离心1分钟；收罗上清液于聚碳酸酯管中，并将千里淀熔解在MESH-BSA中并再次匀浆。将上清液相聚并在11000 x g下离心6分钟。将剩余的松散千里淀用20 mL的12.5% Percol和MESH（v:v）悬浮并离心11000 x g 6分钟。用移液管轻轻倒掉上清液，不干扰线粒体千里淀，后者用0.2 mL MESH/g组织悬浮。线粒体浓度通过BCA测定法细则，并抒发为mg线粒体卵白/g组织。

2.8 全脑和分离的大脑线粒体中复合物I、IV活性、细胞色素c和卵白质羰基的生物化学分析

假手术、载体和二甲双胍处理的大鼠使用冷的磷酸盐缓冲生理盐水（PBS，1X，pH=7.4）进行腹黑灌输，并收罗全脑。大脑被快速冷冻并研磨成粉末，用于测定卵白质羰基浓度和复合物1活性，按照制造商的决策进行。复合物I、IV和细胞色素c的水平使用分离的大脑线粒体按照制造商的决策进行测量。

2.9 统计分析

相连变量的数据以平均值±圭臬误（SEM）清楚。分类数据以频率和比例清楚。关于血流能源学参数测量和动脉血化学分析，接受重叠测量双向方差分析（ANOVA），然后根据需要使用Tukey’s或Sidak’s校正进行过后比较，以比较并吞组内的各异或组间各异。使用Gehan-Breslow-Wilcoxon测验评估大鼠在72小时内存活的比率，以比较两组之间的糊口弧线。关于来自假手术动物以及载体和二甲双胍处理组存举止物的脑组织学比较，使用单向ANOVA后继以Tukey’s多重比较测验来比较组间各异。关于EEG分析，使用重叠测量的双向ANOVA忖度打算BSR，并使用Bonferroni’s多重比较测验，达到50%基线BSR的时候使用未配对Student’s T测验忖度打算。关于其他分析，根据合适情况使用未配对的双尾Student’s t测验、Mann-Whitney U测验或单向/双向ANOVA进行相连变量比较。统计权臣性树立为p<0.05。使用GraphPad Prism 9.1进行统计分析。

三、落幕

3.1 二甲双胍给药改善了10分钟腹黑骤停和复苏后的糊口落幕，并减弱了神经功能禁锢，而不会转换血流能源学或血化学参数

在体重（469.70 ± 7.67 vs 468.70 ± 7.11 g；P=0.85）、达到腹黑骤停的时候（203.10 ± 5.42 vs. 192.40 ± 6.27 s；P=0.26）和达到ROSC的时候（63.75 ± 5.07 vs. 69.95 ± 4.96 s；P=0.29）等方面，载体和二甲双胍处理大鼠的基线特征之间莫得权臣各异。表S2追念了实验中使用的大鼠的一般生理特征。ROSC后立即单次予以二甲双胍，与载体处理大鼠比拟，在72小时内存活率权臣教养（65.0% 对 45.0%；P=0.02；图2）。在ROSC后24、48和72小时进行的神经学评估标明，与载体处理大鼠比拟，存活的二甲双胍处理大鼠神经功能权臣改善（24小频繁P<0.01；48小频繁P< 0.05；72小频繁P<0.01）。

图2. 糊口和神经功能。分析了腹黑骤停10分钟后复苏，载体和二甲双胍处理组在ROSC后72小时内的糊口情况（A）和神经功能（B）。*P<0.05和**P<0.01。

评估载体和二甲双胍处理组ROSC后血浆葡萄糖和乳酸浓度的落幕显现，与各自基线比拟，两组在ROSC后的血糖和乳酸水平莫得权臣各异（图3A）。除在ROSC后60和90分钟时的食管温度外，两组之间的血流能源学参数莫得权臣变化（图3B）。尽管载体组显现的温度处于平淡上限，但它们仍然在实验联想的参数领域内。组内血流能源学变化不权臣，因为它们跟着时候的推移罢黜了与腹黑骤停相似的趋势（表S3）。表1显现了载体和二甲双胍处理组组内动脉血化学分析。尽管两组在ROSC后跟着时候的推移发生了骨子性变化，但大多量参数在两组中显现出相似进程的转换。二甲双胍调整对血流能源学参数和血化学的影响莫得权臣变化，这加强了这种侵扰步调关于腹黑骤停的安全性。总的来说，咱们的数据显现，与载体调整比拟，ROSC后予以二甲双胍似乎不错改善糊口并保护脑功能，而不会权臣转换血化学。

图3. 腹黑骤停后的血流能源学、葡萄糖和乳酸。评估载体和二甲双胍处理组的血浆葡萄糖和乳酸浓度以及血流能源学参数。载体和二甲双胍组之间莫得不雅察到统计学兴味。P<0.001和*P<0.0001。BL，基线；ROSC，自愿轮回复原。

3.2 二甲双胍给药在10分钟腹黑骤停和复苏后改善脑形态学特征并减少神经元损害

使用Nissl和TUNEL染色对CA 1区进行组织学分析，分别检测缺血和凋一火细胞的存在，解说了二甲双胍的调整益处。与假手术动物比拟，载体处理组在海马CA 1区不雅察到了缺血神经元的平均数目权臣加多（P<0.001），而在二甲双胍调整后，与载体处理比拟，缺血神经元的平均数目权臣减少（P<0.01；图4）。不异，与假手术动物比拟，载体处理组在海马中不雅察到TUNEL阳性细胞平均数目权臣加多，标明凋一火（P<0.001）。尽管与假手术组比拟仍较高，但二甲双胍调整后凋一火细胞数目与载体处理比拟权臣减少（P<0.05）。使用NeuN和GFAP染色分别分袂心经元和星形胶质细胞。与假手术组比拟，在腹黑骤停后载体处理组CA 1区神经元数目呈减少趋势（P=0.08），而二甲双胍调整显现出神经元的保留。然则，在三组之间莫得不雅察到星形胶质细胞活化的变化。在ROSC后7天，海马中不雅察到星形胶质细胞磋议。尽管星形胶质细胞的招募可能存在时候延伸，但腹黑骤停后立即导致功能丧失的变化是神经元细胞死字，而二甲双胍似乎不错缓解这一情况。在ROSC后72小时评估大脑细胞特征，落幕显现大脑中存在缺血和凋一火细胞，标明IRI（缺血再灌输损害），而二甲双胍调整不错减弱与载体调整比拟的损害进程。

图4. 二甲双胍改善腹黑骤停后的大脑组织学特征。展示了假手术、载体处理和二甲双胍处理大鼠的海马CA 1区代表性Nissl、TUNEL和NeuN/GFAP染色过甚相应的细胞计数。橙色箭头指令缺血神经元，红色箭头指令凋一火细胞。海马CA1区缺血神经元和凋一火细胞的平均数目在载体处理大鼠中权臣高于假手术大鼠，而在二甲双胍处理大鼠中权臣减少。NeuN/GFAP/DAPI合并图像显现，与假手术组比拟，载体组中NeuN阳性细胞（神经元；绿色）呈减少趋势，而在二甲双胍调整后这一趋势减弱。三组之间GFAP阳性细胞（星形胶质细胞；红色）莫得变化。DAPI（蓝色）指令神经元和星形胶质细胞的细胞核。数据以平均值±SEM清楚。*P<0.05, ** P<0.01, ***P<0.001, 和 ****P<0.0001。

3.3 二甲双胍给药在复苏后早期阶段不转换AMPK卵白和mRNA水平

好多盘考标明，二甲双胍的主要靶标是AMPK。由于缺血导致的氧气和葡萄糖减少会导致能量产生减少，这被感知为AMP/ADP:ATP比例的变化，导致α亚单元的Thr172磷酸化加多，促进领会代谢以匡助补充能量储备。此外，β亚单元的花生酰化和磷酸化有助于AMPK α-Thr172的激活和酶活性。正如之前所展示的，二甲双胍预处理似乎通过调整AMPK水平来提供对腹黑骤停后损害的保护作用。这些有益后果还包括时候维度，其中二甲双胍的慢性调整增强了改善落幕。咱们试图细则ROSC后单次予以二甲双胍是否通过AMPK或其他机制阐发其调整益处。定量分析大脑中p-AMPKα、p-AMPKβ1、总AMPKα和总AMPKβ1/2卵白水平以及AMPKα1、AMPKα2和AMPKβ的mRNA水平，发当今ROSC后2小时，假手术、载体处理和二甲双胍处理大鼠之间莫得权臣变化（图5）。咱们对AMPK过甚多样亚单元的分析标明，二甲双胍蛊卦的AMPK激活在ROSC后早期阶段并未不雅察到。

图5. 二甲双胍不转换腹黑骤停后大脑AMPK mRNA和卵白含量。二甲双胍调整在腹黑骤停后早期阶段不转换大脑中AMPK的水平。对假手术、载体处理和二甲双胍处理大鼠ROSC后2小时的大脑组织进行卵白质分析，发现p-AMPKα、p-AMPKβ1、总AMPKα和总AMPKβ1/2的水平莫得各异。不异，mRNA分析也显现AMPKα1、AMPKα2和AMPKβ的抒发莫得各异。

3.4 二甲双胍通过细致腹黑骤停后复合物I活性缩小、细胞色素c开释和氧化应激来守旧线粒体保护

先前的盘考提倡了二甲双胍调整作用的其他非AMPK机制。由于线粒体是腹黑骤停后受到严重影响的 主要细胞器，咱们试图评估二甲双胍对大脑线粒体的影响。尽人皆知，二甲双胍不错凯旋影响线粒体的复合物I。咱们分析了全脑匀浆和分离的大脑线粒体中复合物I的活性。由于线粒体浓度较低，脑匀浆中复合物I的活性较低；各组之间的活性莫得权臣各异（图6）。然则，对分离的大脑线粒体中复合物I的分析显现，与假手术线粒体比拟，载体处理大鼠在分离的线粒体中复合物I活性权臣缩小（P<0.05）。然则，二甲双胍处理的大鼠在分离的线粒体中复合物I活性莫得缩小，这标明腹黑骤停后二甲双胍调整可能有助于细致复合物I活性的缩小。复合物IV活性在腹黑骤停后莫得变化。咱们还测量了细胞色素c，这是线粒体的主要因素，有助于ATP的产生。与假手术和二甲双胍处理的大鼠比拟，载体处理的大鼠在分离的大脑线粒体中细胞色素c保留量权臣减少（P<0.05），这标明二甲双胍有助于保护腹黑骤停后的线粒体并减少大脑中细胞色素c的开释。与假手术组比拟，载体处理组的脑卵白羰基浓度（清楚氧化损害）权臣加多（P<0.05），而二甲双胍调整减弱了氧化损害。总的来说，咱们的数据标明，腹黑骤停后二甲双胍给药大概细致复合物I活性的丧失，保执线粒体齐全性（如细胞色素c的保留所示），并减弱大脑的氧化损害。

图6. 二甲双胍保护腹黑骤停后线粒体复合物I活性和细致细胞色素c的丢失。总脑匀浆中复合物I活性较低。与假手术和二甲双胍处理组比拟，载体处理组的总脑卵白羰基浓度（当作氧化损害的替代标志物）权臣较高。评估分离的大脑线粒体中复合物I活性，发现载体处理组的活性较假手术组缩小，而二甲双胍处理组显现出活性的平淡化。分离线粒体中的复合物IV活性在三组之间莫得各异。评估细胞色素c的保谅解况，这是线粒体和细胞健康的标志，发现载体处理组中细胞色素c严重丢失，而二甲双胍调整细致了线粒体中细胞色素c的丢失。数据以平均值±SEM清楚。*P<0.05；**P<0.01。

3.5 二甲双胍给药增强腹黑骤停10分钟后复苏早期EEG举止的平淡化

评估腹黑骤停后大脑复原情况相当病笃，尤其是在尝试评估潜在神经保护侵扰步调的有用性时。然则，神经元损害的关键时期是在ROSC后的早期阶段。EEG举止还是被用于评估腹黑骤停后昏厥患者的神经学复原情况。在复苏后24小时内执续的等电位、低电压举止或低爆发-遏制模式 EEG举止预示着预后不良，而在12小时内快速复原至相连模式与更好的神经学落幕热烈联系。咱们在腹黑骤停后测量了ROSC后2小时内的EEG变化，以细则复苏后早期阶段二甲双胍的调整益处。二甲双胍调整显现出与载体调整比拟，EEG早期爆发频率模式的加多（图7）。总爆发-遏制比率（BSR），显现神经元放电进程与举止勤勉相对比，在ROSC后随时候加多，而且在二甲双胍调整后在ROSC后100和110分钟时权臣高于载体（P<0.05；图7C）。此外，达到基线BSR 50%的时候（载体组95.00 ± 12.04分钟对二甲双胍组63.33 ± 4.94分钟；P<0.05）和BSR平淡化的时候（载体组146.20 ± 16.05分钟对二甲双胍组92.40 ± 13.11分钟；P<0.05）在二甲双胍调整后权臣缩小，这标明二甲双胍在ROSC后早期阶段赋予其神经保护作用（图7，D和E）。

图7. 腹黑骤停后EEG守旧二甲双胍调整的公正。电极植入图用于EEG纪录（A）。与载体调整比拟，二甲双胍调整显现出EEG早期爆发频率模式的加多，如原始EEG所示（B）。总爆发-遏制比率显现出ROSC后随时候加多的趋势，二甲双胍调整在ROSC后100和110分钟时权臣高于载体（C）。达到50% BSR的时候（D）和BSR平淡化的时候（E）在二甲双胍调整后权臣缩小。数据以平均值±SEM清楚。*P<0.05。BL，基线；Vecu，维库溴铵；PR10，ROSC后10分钟；PR40，ROSC后40分钟；PR70，ROSC后70分钟；PR100，ROSC后100分钟。

四、论断

腹黑骤停是一种毁掉性的疾病经由，会导致全身性缺血再灌输损害（IRI），大多量患者无法存活。腹黑骤停后的大脑损害被合计是导致不良落幕的主要起首。此外，大脑线粒体受到严重损害，其膜脂质构成发生转换，以及能量生成中心平淡功能的毁坏。因此，减弱腹黑骤停后大脑线粒体损害是开发调整腹黑骤停侵扰步调的病笃探索路子。二甲双胍具有高安全性档案，在调整糖尿病方面具有权臣疗效，同期在其他疾病，如软弱、癌症和缺血等方面也显现出多种有益后果。由于还是解说它不错与线粒体互相作用，咱们假定在腹黑骤停后予以二甲双胍可能有助于减弱大脑线粒体损害，并带来有益的落幕。在咱们的盘考中，咱们发现与载体比拟，二甲双胍调整权臣教养了72小时的存活率（图2）。此外，咱们还不雅察到，与载体调整大鼠比拟，二甲双胍调整在24小时、48小时和72小时显现出神经功能保留权臣更高。腹黑骤停后的全局IRI会在大脑中产生执续的损害，并随时候演变。尽管咱们有积极的糊口发现，但评估腹黑骤停后大脑的细胞损害仍然很病笃。因此，咱们在腹黑骤停后3天的组织学分析显现，用二甲双胍调整的大鼠海马CA 1区的大脑中缺血和凋一火细胞数目权臣减少（图7）。咱们的积极落幕指示二甲双胍可能是调整腹黑骤停的潜在调整路子。

不雅察到腹黑骤停后落幕的改善，咱们进一步思要探索这些调整后果背后的机制。然则，值得防御的是，由于腹黑骤停的复杂性和二甲双胍的多个靶点，评估二甲双胍的机制是具有挑战性的。二甲双胍和AMPK的凯旋互相作用一直难以捉摸。有东谈主建议，在好多机制中，AMPK可能通过凯旋或线粒体路子被二甲双胍激活。在腹黑骤停布景下使用二甲双胍的独一尝试是在腹黑骤停前2周提供二甲双胍。盘考标明，二甲双胍通过蛊卦AMPK依赖的自噬激活来产生有益的落幕。咱们假定，要是二甲双胍的调整后果所以AMPK介导的方式，那么咱们应该不雅察到即使在腹黑骤停后提供，AMPK α和β的磷酸化也会加多。然则，咱们不雅察到，腹黑骤停引起的严重IRI并莫得导致假手术组、腹黑骤停后载体处理组或腹黑骤停后二甲双胍处理组大脑中AMPK的α或β亚单元的卵白质浓度或mRNA水平出现主要各异（图5）。这标明，尽管AMPK激活可能是二甲双胍调整后果的潜在机制，但这条路子可能在ROSC后早期阶段并不触及。

跟着线粒体在腹黑骤停损害中的作用变得愈加开荒，而且大脑中AMPK的变化最小，咱们的下一个忖度打算是评估腹黑骤停后予以二甲双胍的大脑线粒体。评估分离的大脑线粒体中复合物I活性的落幕显现，载体处理组的复合物I活性权臣缩小，这是预期之中的，而且还是在之前的盘考中获得了考据。然则，二甲双胍调整细致了活性的缩小（图6）。尽管东谈主们合计二甲双胍会遏制线粒体复合物I，但咱们的落幕却标明相背。二甲双胍的剂量和调整执续时候对其在体内的作用有凯旋影响。高局部浓度的二甲双胍（>1mM）被合计是超药理学的，不错部分或澈底遏制线粒体复合物I。值得防御的是，咱们的100 mg/Kg剂量，在大鼠全身中的最大浓度可能低于咱们预期的10 mM，这可能足以调整而不是遏制复合物I活性。事实上，复合物I在二甲双胍剂量下的活性显现出不同的后果，甚至于更高剂量执行上不错加多活性，并具有其他非线粒体机制的作用，如遏制线粒体甘油磷酸脱氢酶（mGPD）等。因此，咱们腹黑骤停后权臣糊口落幕与二甲双胍与复合物I的互相作用之间的因果关系仍需要更多的探索。

盘考标明，二甲双胍可能不是遏制复合物I，而是厚实复合物I的非活性情势，这不错减弱反向电子传递（RET）介导的活性氧（ROS）生成，并率领电子上前流动，以促进线粒体举止。细致线粒体功能丧失，关于保管细胞齐全性并细致细胞死字相当病笃。咱们思要评估在72小频繁大脑中凋一火细胞减少的任何早期二甲双胍保护的笔据（图7）。咱们发现，二甲双胍调整后大脑中卵白质羰基化的浓度权臣缩小，这标明卵白质氧化损害减少（图6B）。这一落幕与之前的盘考一致，标明二甲双胍减少了RET。此外，要是电子的正确流动得以保管，线粒体齐全性将获得保留。咱们不雅察到，腹黑骤停后予以二甲双胍调整的大鼠分离线粒体中细胞色素c的保留权臣改善（图6E）。这最小化了资历凋一火的细胞数目，导致神经元逝世减少，并不雅察到神经功能的改善。

尽管存活的鼠在腹黑骤停后24小时运行显现出大脑功能的改善，但咱们思要进一步走访二甲双胍是否大概在ROSC后的早期阶段赋予其益处。在盘考二甲双胍对大脑早期影响的一个有价值器具是EEG。在大脑血液轮回丧失后，厚着实几秒钟内丧失。这不错不雅察到腹黑骤停后EEG爆发模式的丧失，标明大脑举止不存在。这种模式在ROSC后执续，其平淡化不错指令大脑功能的复原（图7B）。然则，复原平淡的时候越长，或者澈底莫得复原平淡，标明严重的大脑损害和可能的脑死字。在ROSC后予以二甲双胍不错促进EEG举止的加多，并比载体调整更快地复原平淡EEG（图7，C-E）。这明晰地标明，二甲双胍在ROSC后早期阶段在神经保护方面是有用的。复合物I活性的保留，大脑卵白质氧化损害的减少，以及细胞色素c的保留，可能齐导致了大脑举止的早期平淡化。二甲双胍的这种早期大脑保护可能是导致72小时举座糊口和大脑功能改善的机制。

二甲双胍在ROSC后早期阶段改善了大脑举止，教养了糊口率，并细致了神经元细胞死字。探索给药剂量和时候的必要性是下一步。优化调整领域，终点是要是单次给药，关于细致装潢腹黑骤停后糊口的反作用相当病笃。由于好多患者正在接受逐日二甲双胍的药物调整，评估腹黑骤停后急性调整与慢性调整药理布景下的附加后果很病笃。急性调整在腹黑骤停后可能仍然保留咱们在慢性二甲双胍调整患者中不雅察到的线粒体介导的有益后果。然则，机制和调整各异需要澄清，因为它们将更好地为东谈主类患者贬责提供信息。腹黑骤停后急性对慢性调整中也可能不雅察到AMPK激活。咱们的忖度打算是提供ROSC后立即阶段的二甲双胍，这是执续糊口的关键时期。在复苏经由中或ROSC后更晚的时候点予以二甲双胍可能会转换其益处。尽管咱们展示了二甲双胍保留了复合物I活性并保留了细胞色素c，从而提供了线粒体保护，但咱们无法评估线粒体呼吸智力。需要对二甲双胍与线粒体的互相作用进行更深刻的分析，并探索二甲双胍与内质网等其他细胞器的关系，这些细胞器已被牵缠到腹黑骤停后IRI。

尽管存在一些局限性，咱们的盘考是首个解说在腹黑骤停（CA）后予以二甲双胍调整具有积极疗效的盘考，这种疗效似乎是通过在复苏后早期阶段大脑中的线粒体调整而非AMPK激活介导的。二甲双胍精深使用，具有高安全性，而且在腹黑骤停后似乎能带来权臣益处，具有临床滚动后劲。咱们的盘考守旧将二甲双胍当作腹黑骤停后的侵扰步调，以带来糊口益处，增强早期脑电图举止，并保护大脑功能。

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